2016 年底，國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)發(fā)布了最新版《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》(GB5009.6－2016) ［1］ ，該標(biāo)準(zhǔn)整合并替代了 GB/T 5009.6－2003 ［2］ 、GB/T 9695.1－2008 ［3］ 、GB 5413.3－2010 ［4］ 、GB/T 9695.7 － 2008 ［5］ 、GB/T 14772 － 2008 ［6］ 、GB/T5512－2008 ［7］ 、GB/T 15674－2009 ［8］ 、GB/T 22427.3－2008 ［9］ 、GB/T 10359－2008 ［10］ 等 9 個(gè)食品及相關(guān)產(chǎn)品中脂肪檢測的國家標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)適用于水果、蔬菜及其制品、糧食及糧食制品、肉及肉制品、蛋及蛋制品、乳及乳制品和嬰幼兒配方食品等產(chǎn)品中脂肪的測定。
該標(biāo)準(zhǔn)為食品中脂肪含量測定通用國家標(biāo)準(zhǔn)，為食品生產(chǎn)企業(yè)內(nèi)部質(zhì)控、檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)依法檢測判定提供了標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。但是食品種類紛繁復(fù)雜，脂肪存在形式多樣，脂肪檢測常用的四種方法其原理依據(jù)也各不相同，所以通用性檢測標(biāo)準(zhǔn)可能存在選擇性差的缺點(diǎn)
［11－15］ 。GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)僅說明了其與 GB/T 5009.3－2003 標(biāo)準(zhǔn)的差異，而沒有比較其與被其替代的其他標(biāo)準(zhǔn)的不同之處，其中不乏部分重要的解釋說明或限定的測試條件。所以本文就 GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)的檢測原理、適用范圍、與被其替代標(biāo)準(zhǔn)的差異等方面進(jìn)行解讀和分析，并對標(biāo)準(zhǔn)文本中未提到、或解釋不全的技術(shù)要素進(jìn)行了分析探討，讓檢測人員知其然亦知其所以然，以提高檢測效率。
1 檢測原理
GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)所列的索氏提取法、酸水解法和堿水解法的基本過程，都是用有機(jī)溶劑提取脂肪，然后通過蒸發(fā)去除有機(jī)溶劑，干燥后最后測得脂肪含量。索氏提取法［16－17］ 中一般以乙醚作為提取劑，提取的物質(zhì)除中性脂肪外，還有游離脂肪酸、蠟、磷脂、固醇及色素等脂溶性物質(zhì)，故提出物只能稱為粗脂肪。索氏提取是有機(jī)物提取常用且提取率較高的方法，但是由于乙醚不能充分滲入樣品顆粒內(nèi)部，或由于脂類與蛋白質(zhì)或碳水化合物形成結(jié)合脂，特別是對于容易吸潮、結(jié)塊、難以烘干的食品，用索式抽提法并不能將其中的脂類完全提取出來。酸水解法［18－19］ 可與索氏提取法結(jié)合，以提取產(chǎn)品中不同存在方式的脂肪［20－21］ 。酸水解法(包括巴布科克法)和堿水解法(又稱羅紫－哥特里(Ｒose－Gottlieb)法)的原理相似:用酸或堿分解非脂肪組分，再用有機(jī)溶劑萃取，得游離態(tài)脂肪和結(jié)合態(tài)脂肪之和即總脂肪含量。但是酸水解法不適用于高糖或高磷脂樣品的處理，因?yàn)樵跓釓?qiáng)酸條件下，糖類易碳化，磷脂易分解為脂肪酸和堿［22］ 。
表 1 脂肪檢測方法基本情況比較分析Table 1 Comparison and analysis of the basic situation of fat detection methods方法名稱 測定參數(shù) 適用范圍 不適用情況 過程及結(jié)果評(píng)價(jià)索氏提取法 游離態(tài)脂肪一般食品:脂肪含量較高，含結(jié)合態(tài)脂肪較少，能烘干磨細(xì)，不易吸潮結(jié)塊的樣品。結(jié)合態(tài)脂肪 耗時(shí)長易偏低酸水解法
游離態(tài)及結(jié)合態(tài) 脂 肪 或 總脂肪某些食品，其所含脂肪包含于組織內(nèi)部，如淀粉及其焙烤制品(面條、面包之類)，由于乙醚不能充分滲入樣品顆粒內(nèi)部，或由于脂類與蛋白質(zhì)或碳水化合物形成結(jié)合脂，特別是容易吸潮、結(jié)塊、難以烘干的食品。
高磷脂或高糖食 品，如 魚 貝蛋等固體樣品前處理及索氏提取繁瑣，易碳化或分解而偏低堿水解法游離態(tài)及結(jié)合態(tài) 脂 肪 或 總脂肪巴氏殺菌乳、滅菌乳、生乳、發(fā)酵乳、調(diào)制乳、乳粉、煉乳、奶油、稀奶油、干酪和嬰幼兒配方食。除上述乳制品外，還適用于豆乳或加水顯乳狀的食品。非乳狀食品國際通用乳及乳制品檢測方法 ［17］
蓋勃法
游離態(tài)及結(jié)合態(tài) 脂 肪 或 總脂肪巴氏殺菌乳、滅菌乳、生乳。高糖或高磷脂食品及非乳狀食品精確度低，易碳化或分解而偏低GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)在酸水解法中對肉制品和淀粉的前處理做了特殊規(guī)定，所以酸水解法理應(yīng)適用于肉制品、淀粉的總脂肪或脂肪含量測定，但是標(biāo)準(zhǔn)并未對含淀粉食品是否也可以用酸水解法來檢測進(jìn)行說明，而王毅等［19］ 的研究表明，含淀粉且高糖類的食品，如中式糕點(diǎn)，則不適合用酸水解法檢測。非乳制品脂肪測定應(yīng)當(dāng)以索氏提取法為基礎(chǔ)，了解食品中脂肪存在的主要形式，除高磷脂或高糖的情況，其余均可以考慮同時(shí)用酸水解法。乳及乳制品則以堿水解法為仲裁方法，蓋勃法為補(bǔ)充。李鵬等［23－24］ 的研究表明，在 GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)中未被采用的氯仿－甲醇法，適用于含結(jié)合態(tài)酯類比較高，特別是磷脂含量高的樣品，如鮮魚、貝類、肉、禽、蛋等，對于含水量高的樣品則更為有效。
2 標(biāo)準(zhǔn)方法適用情況
被 GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)替代的 9 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中，明確規(guī)定測定參數(shù)為粗脂肪的有 4 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、游離脂肪的有 1 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)、總脂肪的有 3 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。所以在應(yīng)用GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，需要對測定參數(shù)和檢測范圍進(jìn)行再確認(rèn)。GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)中脂肪檢測方法基本情況見表 1。
3 檢測方法差異及分析
3.1 試樣前處理
3.1.1 干燥助劑或碾磨助劑 GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)對于固體樣品前處理過程，沒有提出需要添加干燥助劑或碾磨助劑，而多個(gè)被替代標(biāo)準(zhǔn)中均提出，樣品前處理時(shí)需加入干燥助劑或碾磨助劑［16］ (海沙、石英砂、無水硫酸鈉、硅藻土等)，因?yàn)楦稍镏鷦?組織疏松劑)可以用于水分含量較大、粘稠度高的樣品，提高干燥程序，有利于前處理過程。對于某些難于磨碎的樣品，如糧食、油料餅粕等，加入適量的碾磨助劑，可以協(xié)助碾磨，也可以降低溫度，以免脂肪在溫度過高時(shí)氧化。另外，加入的助劑還需具有一定的吸附能力，當(dāng)油脂由于碾磨過度溶出較多時(shí)，不至于被容器吸附或揮發(fā)，而是被吸附在助劑中，因此，被替代標(biāo)準(zhǔn)［2，6－8，10］ 中均要求將助劑及擦拭器皿的擦拭紙轉(zhuǎn)移至萃取裝置中，防止脂肪過度溶出損失。
3.1.2 萃取前干燥處理 索氏提取法使用有機(jī)溶劑抽提，適用于干燥而分散的樣品。當(dāng)使用乙醚作為提取劑時(shí)，乙醚中 1.5% ～2% 水分能夠使樣品中的非脂類水溶性物質(zhì)隨著脂肪一同被提取出來，從而增加測試結(jié)果的正誤差［25］ 。在舊版的 5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中均在抽提前對樣品進(jìn)行了去水操作，例如肉類［3］ 和食用菌［8］ 需在(103 ±2) ℃溫度下干燥30～60 min;中式糕點(diǎn)和西式糕點(diǎn)需分別在(103 ±2) ℃和(90 ±2) ℃溫度下干燥 2 h ［6］ ; 糧食 ［7］ 需在 105 ℃ 溫度下干燥30 min;油餅［10］ 需在 80 ℃溫度下水浴加熱 30 min 或加無水硫酸鈉等。GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定直接使用無水乙醚，要求對液體或半固體試樣進(jìn)行干燥處理，對固體樣品沒有要求，簡化了固體試樣的前處理步驟。
3.1.3 制樣細(xì)度要求 需要測定脂肪含量的食品種類紛繁復(fù)雜，脂肪存在方式各異，GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)為對樣品細(xì)度未做特殊規(guī)定，而被替代標(biāo)準(zhǔn)及相關(guān)文獻(xiàn)有所規(guī)定，一般情況下，肉及肉制品需要在絞肉機(jī)內(nèi)至少攪碎兩次［2－3］ ，部分標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定需要過 40 目篩子［2］ ，對于糧油產(chǎn)品和食用菌樣品，需要過 1、0.9 mm 圓孔篩子［7－8］ ，對于油料餅粕等脂肪含量高、難以干燥和碾碎的樣品則做了更加細(xì)致的規(guī)定［10］ 。如果不對樣品細(xì)度進(jìn)行規(guī)定，很難保證脂肪抽提的完全性，必然會(huì)造成結(jié)果的誤差。
3.2 提取劑的選擇
GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)中索氏提取法和酸水解法使用的抽提劑為無水乙醚或石油醚，堿水解法使用無水乙醚和石油醚進(jìn)行萃取。標(biāo)準(zhǔn)［7］ 和文獻(xiàn) ［16］ 中均有說明:不能用石油醚代替乙醚，因?yàn)樗荒苋芙馊康闹参镉椭愇镔|(zhì)。因此，實(shí)驗(yàn)中抽提劑選擇無水乙醚優(yōu)于石油醚［27］ 。文獻(xiàn)中也有使用正己烷、三氯甲烷－甲醇、二硫化碳等作為提取劑的情況［28－29］ ，但此類試劑毒性較大，未被標(biāo)準(zhǔn)采用。
3.3 干燥溫度
脂肪種類繁多，其中芳香性油脂、揮發(fā)性油脂和熱不穩(wěn)定油脂在脂肪測定中，需要控制干燥至恒重的溫度和時(shí)間［29］ ，GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定恒溫條件為95～105 ℃，1 h。相比而言，最高溫度略高、恒重時(shí)間略短于其他標(biāo)準(zhǔn)。溫度過低不能達(dá)到干燥恒重的效果，溫度過高芳香性油脂、揮發(fā)性油脂和熱不穩(wěn)定油脂等容易揮發(fā)損失造成負(fù)誤差，如椰子油、棕櫚仁油等，干燥溫度不宜高于 80 ℃，溫度過高，其中的熱不穩(wěn)定油脂或分解或氧化造成數(shù)據(jù)失真［29］ ，所以具有揮發(fā)性油脂的測定不在 GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)測定范圍內(nèi)。因此，建議在分析可能含有芳香性油脂、揮發(fā)性油脂和熱不穩(wěn)定油脂的樣品時(shí)，不采用此法。其脂肪的測定，一方面要控制恒重條件，降低溫度，或減少干燥時(shí)間，避免芳香性油脂的揮發(fā)和損失，可以采用真空干燥箱或惰性氣體保護(hù)來干燥;另一方面注意實(shí)驗(yàn)觀察，如果有色澤、氣味上的變化，就應(yīng)該修改實(shí)驗(yàn)方案。
3.4 驗(yàn)證提取
食品中脂肪檢測的關(guān)鍵控制點(diǎn)在脂肪抽提或者溶出效率，即是否完全將食品中的脂肪轉(zhuǎn)移到了有機(jī)溶劑中［28－29］ 。各標(biāo)準(zhǔn)中索氏提取耗時(shí)較長，對于不同的樣品的提取溫度、回流速率及抽提時(shí)間也有差異，不同樣品脂肪抽提所采用的標(biāo)準(zhǔn)及建議條件如表 2 所示。
以乙醚為萃取溶劑時(shí)，加熱溫度一般為 65～75 ℃。具體溫度，視抽提管中乙醚回流速度而定，一般以 3～5 min 虹吸一次為標(biāo)準(zhǔn)。水浴溫度過高，乙醚流失，導(dǎo)致結(jié)果偏低［26］ 。所以驗(yàn)證提取是否完全成為實(shí)驗(yàn)質(zhì)控的重要環(huán)節(jié)。觀察實(shí)驗(yàn)如出現(xiàn)以下三種情況中的一種可以認(rèn)為提取完全:a.二次抽提，二次抽提產(chǎn)物恒重增量不超過0.1% ［3，5］ ;b.觀察抽提液乙醚滴在毛玻璃片上無油跡殘留［6，8］ ;c.抽提至抽提管內(nèi)的乙醚用玻璃片檢查無油跡［7］ 。
GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)采用 b 法，具有較好的操作性和準(zhǔn)確性。
3.5 空白試驗(yàn)
空白實(shí)驗(yàn)一方面可以用于試劑驗(yàn)收，對于存在非揮發(fā)性物質(zhì)的試劑，GB 5413.3－2010 乳與乳制品脂肪檢測中需要進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，以 10 mL 水代替樣品進(jìn)行測試，得出試劑空白，該值通常小于0.5 mg，在常規(guī)測定中，可忽略不計(jì)。如果全部試劑空白殘余物大于0.5 mg，則分別蒸餾100 mL 乙醚和石油醚，測定溶劑殘余物的含量，用空的控制瓶測得的殘余量和每種溶劑的殘余物的含量都不應(yīng)超過 0.5 mg，否則應(yīng)更換成合格的試劑或?qū)υ噭┻M(jìn)行提純。另一方面空白實(shí)驗(yàn)還用于驗(yàn)證抽提效果和環(huán)境條件的校準(zhǔn)，在 GB 5413.3－2010 中利用無水奶油(1 g)與樣品同時(shí)測定，以進(jìn)行空白試驗(yàn)，對測量操作和儀器設(shè)備進(jìn)行同步驗(yàn)證。
在 GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)中僅對乳及乳制品、嬰幼兒配方食品中脂肪測定的堿水解法做了空白實(shí)驗(yàn)要求，其余樣品及方法未做空白實(shí)驗(yàn)做解釋，可以認(rèn)為一般情況下脂肪測定不需要做空白實(shí)驗(yàn)，但是在試劑驗(yàn)收和初次試驗(yàn)驗(yàn)證時(shí)，還是應(yīng)進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)［28－29］ 。
3.6 試劑驗(yàn)收與回收由于乙醚中含有水分、乙醇等均會(huì)干擾脂肪的提取，使得提取物中含有糖類等非脂類成分［4］ ，會(huì)引起正誤差。所以 GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定使用的提取劑為無水乙醚。另一方面乙醚中如含有過氧化物，索氏提取操作容易發(fā)生爆炸［4，7，26］ 。實(shí)驗(yàn)室在采購乙醚后，可試試劑品質(zhì)參照文獻(xiàn)［26］進(jìn)行除氧化物、除水、除醇、操作。
為提高實(shí)驗(yàn)室環(huán)境友好度、降低檢測成本，對脂肪測定中使用過的乙醚可以重復(fù)利用，重復(fù)利用前［4，7，26］ 可參照文獻(xiàn)方法先做過氧化物檢驗(yàn)及處理［4，26］ ，再進(jìn)行脫水處理 ［26］ 。
4 結(jié)論與展望
GB 5009.6－2016 標(biāo)準(zhǔn)整合并替代了之前的 9 個(gè)國家標(biāo)準(zhǔn)，是測定食品中脂肪含量的國家食品安全強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)，為生產(chǎn)企業(yè)開展內(nèi)部質(zhì)控、檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)依法檢測判定等提供了標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)。但是，該標(biāo)準(zhǔn)也存在一些通用型標(biāo)準(zhǔn)普遍存在的問題，比如標(biāo)準(zhǔn)適用范圍規(guī)定不具體，前處理過程描述偏于簡略等問題。而同時(shí)又因?yàn)槭称贩N類紛繁復(fù)雜，脂肪存在形式多樣等特殊情況，所以，檢測人員在實(shí)際檢測過程中，必須在深刻理解檢測方法基本原理基礎(chǔ)上，根據(jù)樣品的具體特性，細(xì)化操作步驟和要求，并通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證形成作業(yè)指導(dǎo)書，以便更加規(guī)范操作過程，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。